INTRODUCCIÓN A LOS EPISODIOS NOCIVOS POR FITOPLANCTON

 

DETECCIÓN DE TOXINAS

Toxinas que afectan al hombre.

Las principales toxinas de origen fitoplanctónico, que tienen efecto sobre el hombre, pueden detectarse mediante el empleo de dos grupos de técnicas: estructurales y funcionales (Cembella et al. 1995). Ambos tienen ventajas e inconvenientes, pero los más utilizados en la actualidad para fines de control son las funcionales, especialmente los bioensayos con ratón.

En las técnicas funcionales, se someten determinados animales o determinados productos a la acción del material que contiene los tóxicos. Este material produce una reacción en el substrato del ensayo, que puede ser la muerte de un ratón, el bloqueo de un canal iónico, o cualquier otra relacionada con su actividad sobre los organismos. En las estructurales, la concentración de los diversos compuestos tóxicos se determina utilizando sus propiedades físico-químicas. Las funcionales, por tanto, cuantifican la toxicidad (cuantificando el efecto de las toxinas), mientras que las estructurales cuantifican la concentración de toxina o toxinas. De esta diferencia derivan la mayor parte de las ventajas e inconvenientes que tiene cada uno de estos tipos de cuantificación. En las funcionales, es frecuente que, en el caso de trabajar con una mezcla de toxinas, las contribuciones individuales de cada una de ellas son indistinguibles. Esto, no supondría un problema especial sino que más bien sería deseable –ya que daría una estimación exacta de su peligro- si no fuera porque, en general, la sensibilidad de los organismos o reacciones con las que se ensaya, para diferentes toxinas, no es exactamente la misma que la que tiene el hombre. Las técnicas estructurales, por otra parte, podrían ser más útiles que las anteriores dado que cuantifican las concentraciones de cada una de las toxinas en la mezcla. Conociendo el efecto de cada una de las toxinas sobre el hombre resultaría inmediato el cálculo de la toxicidad precisa para el hombre. El problema real es que estos datos raramente se conocen y mucho menos los correspondientes a las presumibles interacciones entre ellos.

Existen diversos tipos de técnicas funcionales que se utilizan para cuantificar la toxicidad. Las de utilización más frecuente son los bioensayos, que miden el efecto sobre organismos completos o sobre células. De entre ellos, el más frecuente y ampliamente utilizado de entre todos es, con mucho, el bioensayo de ratón, que consiste en extraer las toxinas de los bivalvos utilizando los solventes adecuados y después, una vez eliminados los solventes que pudieran interferir con el resultado, inyectarle el extracto intraperitonealmente a ratones (habitualmente machos de 20 g de peso). La acción de las toxinas les produce la muerte en un tiempo que tiene con la concentración una relación hiperbólica, por lo cual en la medida en la que la concentración es menor, la capacidad del bioensayo para estimar adecuadamente la concentración de toxinas se hace mucho menor. La principal ventaja de este bioensayo es que puede detectar toxinas desconocidas, lo cual representa una importante garantía para la salud pública, y que está ya integrado en las regulaciones de muchos países. Los principales inconvenientes son que en ocasiones (ASP y DSP) sus niveles de detección están próximos a los niveles de toxinas que producen efectos en el hombre, y que supone, para un sistema de control, sacrificar gran número de animales para este fin, algo contra lo que la sociedad está cada vez más sensibilizada. Otros dos bioensayos con gran potencial son los que utilizan neuroblastoma y bacterias luminiscentes. El primero de ellos, se basa en que determinados compuestos, como la veratridina y la ouabaína, producen la apertura del canal del sodio, lo cual lleva a la muerte celular. Las toxinas de tipo PSP (saxitoxina y compuestos relacionados) y la tetrodotoxina, compiten con estos compuestos ligándose al canal del sodio y bloqueándolo, lo cual impide que actúen esos dos compuestos y, por tanto, la muerte celular. La medida en la que una muestra disminuye la mortalidad de las células provocada por los dos compuestos citados, es proporcional a la cantidad de sustancias bloqueantes del canal del sodio que contienen y, por tanto, presumiblemente de saxitoxinas y tetrodotoxinas. Esta técnica presenta el inconveniente fundamental de que resulta dependiente del estado de los cultivos celulares de neuroblastoma, por lo cual ha sido objeto de diversas modificaciones que desembocaron en el desarrollo de un kit en el cual las células están en condiciones muy homogéneas (Jellett et al. 1998). Se han utilizado también radio-ensayos de ligamiento competitivo a sinaptosomas de rata. En este caso, al tratar los sinaptosomas con saxitoxina marcada radiactivamente, ésta se liga a los canales del sodio que están libres. Si los sinaptosomas son expuestos a una mezcla de saxitoxina tritiada y de la muestra cuya toxicidad se quiere cuantificar, la radiactividad que retengan será proporcional a la cantidad de los compuestos con capacidad para ligarse al canal del sodio que estén presentes en la muestra problema, presumiblemente toxinas en su mayor parte (Cembella et al. 1995). Aunque esta técnica se desarrolló inicialmente para toxinas PSP, posteriormente se desarrollaron otras modificaciones que emplean brevetoxina y cido kainico tritiados para cuantificación de NSP y ASP, respectivamente (revisado en Cembella et al. 1995). Recientemente se han comenzado a utilizar bioensayos con bacterias (Glover et al. 2000) a las que se han transferido genes para dotarlas de luminiscencia y que fueron originalmente utilizadas para cuantificar la toxicidad acuática (Belkin 1998, Briscoe et al. 1998). Estos ensayos son muy sencillos de realizar ya que la luminiscencia desaparece cuando los compuestos que se añaden son tóxicos para dichas bacterias. Aunque, evidentemente, este tipo de ensayo no es específico sí puede utilizarse como comprobación previa al bioensayo de ratón o a otras técnicas más adecuadas.

En otros casos, cuando el receptor de las toxinas está muy implicado en la actividad de un enzima, como es el caso del cido okadaico y toxinas relacionadas, que son potentes inhibidores de la fosfatasa PPA2, los ensayos de actividad de ésta, son adecuados para cuantificar sus concentraciones (Botana et al. 1997).

Cuando están implicadas toxinas que afectan a los organismos marinos, pero cuyos mecanismos de acción no se conocen, es frecuente utilizar bioensayos con diversas especies de distintos grupos taxonómicos, pero seleccionados de forma que su cultivo u obtención no presente grandes dificultades. Tal es el caso, por ejemplo, con Artemia salina, de los ensayos con huevos de erizo de mar y de muchos otros habitualmente utilizados en toxicología acuática (ver Wells et al. 1998).

De entre los métodos estructurales destacan los análisis químicos y los inmunoensayos. La analítica de las toxinas marinas emplea fundamentalmente la separación cromatográfica por HPLC seguida de la detección de las toxinas, en ocasiones requiriendo una reacción química previa (precolumna) o posterior (postcolumna) a la separación cromatográfica, seguida de la detección de las toxinas o de sus derivados habitualmente por medio de espectroscopía UV, espectrofluorimetría o espectrometría de masas (Franco and Fernández-Vila 1993, Quilliam et al. 1989, Pocklington et al. 1990, Quilliam and Wright 1995, Wright and Quilliam 1995). Los inmunoensayos, como ya comentamos en el apartado de detección del fitoplancton, en la reacción de las toxinas con anticuerpos contra ellas, cuya formación se ha inducido previamente en mamíferos. Existen diversos métodos tanto para la producción de los anticuerpos como para hacer fácilmente detectable la reacción (revisado en Cembella et al. 1995). Se trata de técnicas rápidas, sensibles y cómodas, pero que suelen ser bastante específicas para una toxina, mostrando poca o ninguna reacción con otras del mismo grupo, a veces presentan reacciones cruzadas con otros compuestos, dando falsos positivos y, en muchas ocasiones, aunque detectan adecuadamente, su precisión cuantificando no es buena.



Detección de Fitoplancton Predicción